一个基因由两个主要功能元素组成:第一个是所谓的编码DNA序列,它提供产生的蛋白质的信息。第二,一个特定的启动子序列连接到编码区域,调节基因的转录。启动子的作用是根据需要激活或抑制基因的表达。

报告基因检测的主要目的是研究相关基因的启动子,即其表达的调控。这可以通过将感兴趣的启动子与一个容易检测到的基因相连接来实现,比如能够催化发光反应的萤火虫荧光素酶基因。

通常,电池暴露在不同的因素或条件下,或者可以按照报告的顺序进行改变,通过测量光发射的变化可以很容易地跟踪其影响。

三星3

三星3是一款用户友好,价格实惠的基于滤光片的多模平板阅读器,提供了高效的吸光度,发光和荧光测量分析

报告基因的例子

常见的报告基因有β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和荧光素酶。多种检测方法(见下文)用于检测表达的报告基因蛋白。这包括发光、吸光度和荧光。

基于发光的分析非常流行,原因如下:

  • 它们有很高的灵敏度(根据特定的检测方法和使用的报告剂,比基于吸收或荧光的方法高10到10000倍)
  • 大多数细胞类型不具有内源性荧光素酶活性
  • 发光分析具有较大的动态范围
  • 他们行动迅速
  • 它们的成本相对较低

发光报告基因测定使用a光度计

报告基因的检测方法

记者 发光 荧光 吸光度
荧光素酶
β牛乳糖(β加)
β葡萄糖醛酸酶(β格斯)
分泌型碱性磷酸酶
绿色荧光蛋白(GFP)

萤火虫荧光素酶

最通用、最常见的报告基因是北美萤火虫的荧光素酶Photinus pyralis。该蛋白不需要翻译后修饰的酶活性。它甚至没有毒性在活的有机体内可用于原核细胞和真核细胞。萤火虫荧光素酶在ATP、镁和氧的存在下催化荧光素的生物发光氧化。

双荧光素酶®报告基因检测

双荧光素酶报告酶(DLR)检测系统包含两种不同的荧光素酶报告酶,在每个细胞中同时表达。萤火虫荧光素酶和海三色堇荧光素酶可以区分它们各自的生物发光底物,而不会交叉激活。萤火虫荧光素酶由兴趣启动子控制,肾荧光素酶由稳定表达的启动子控制;通过这种方式,肾细胞荧光素酶的表达可以用作内部控制,以补偿任何细胞数量的变化、转染效率和其他错误。虽然这很方便,但必须谨慎,以确保所有试验条件都不会改变肾荧光素酶的表达,因为这可能导致错误的结论。

新型荧光素酶

近年来,其他荧光素酶已被用于报告基因分析,如Gaussia,塞浦路纳或NanoLuc®荧光素酶。这些所谓的“新型”荧光酶比萤火虫或肾细胞荧光酶亮1000倍,通常还有其他优点,如稳定性更好,体积更小,细胞外分泌等。

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双荧光素酶和NanoLuc是Promega公司的注册商标。